Multitron CHO 细胞培养

2021-01-22 14:50:41    admin2672 分享

导语：摇瓶的使用对动物细胞的培养越来越重要。以下各种摇瓶中培养CHO（中国仓鼠卵巢）细胞的示例表明，Multitron细胞培养摇床（INFORS HT，CH Bottmingen）适合种子液的生产。

1. 简介
摇瓶的使用对动物细胞的培养越来越重要。以下各种摇瓶中培养CHO（中国仓鼠卵巢）细胞的示例表明，Multitron细胞培养摇床（INFORS HT，CH Bottmingen）适合种子液的生产。

CHO细胞系是生物技术中常用的细胞系。为了生产用于接种的种子培养液和生产SEAP蛋白，使用了CHO-XM-111细胞株。瑞士苏黎世联邦理工学院 M.Fussengerger 教授的团队用编码重组蛋白SEAP（分泌型碱性磷酸酶）基因的表达载体转染该细胞株，并使用由四环素控制的启动子PhCMV-1。表达载体的使用使得通过启动子可选择性表达两个基因成为可能。这样就可以生产SEAP蛋白，包括非生产性的生长阶段，和基于无四环素培养基交换的增殖抑制生产阶段。

2. Multitron 技术参数
*  50 mm 振幅 (可选25mm)
*  通气 空气和  CO2 (0 – 20% asstandard)
*  蒸汽湿度套件（可选）
*  不同可选托盘 (一次培养袋托盘, 粘性托盘，通用托盘等)
*  其他选项 (制冷, 去污, ShakerBag等)

3. 实验条件
为了在生物反应器中生产种子培养液（作为后期培养的接种物）和SEAP，使用CHO-XM-111细胞系，无血清和无蛋白的HP-1培养基（Cell Culture Technologies GmbH）在250 mL、500 mL和1000mL摇瓶中进行培养。在培养基中添加2g/L Pluronic F-68（Sigma）和2.5 mg/L 四环素（Sigma）。设置温度37℃，湿度85% 和5%的CO2饱和度。摇瓶以恒定的122 rpm转速在Multitron（INFORS-HT, CH-Bottmingen）中培养。

4. 批次补料振荡培养
采用不同体积的摇瓶和相应的补料策略。

a) 在250ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行：

天/小时 – 步骤	体积（mL）	每毫升细胞浓度	存活百分比
0 d/0 h – 接种	50	3.0 x 105	86.9
1 d/21 h – 补料	50 (+ 30 mL)	6.6 x 105	91
2 d/43 h	80 (max. 32%)	1.95 x 106	97.4
3 d/67 h	80	2.25 x 106	98.3
4 d/91 h	80	1.95 x 106	98.7

Z大比生长速率μmax为0.048 h^-1，倍增时间td =14.4h。

图1: Multitron

b) 在500ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行：

天/小时 – 步骤	体积（mL）	每毫升细胞浓度	存活百分比
0 d/0 h – 接种	100	7.8 x 105	95.5
1 d/24 h – 补料	100 (+ 50 mL)	1.88 x 106	98.7
2 d/47 h – 补料	150 (+ 50 mL)	2.18 x 106	99.1
3 d/67 h – 更换培养基	250 (+ 50 mL)	2.33 x 106	99.3
4 d/91 h	300 (max. 60%)	2.63 x 106	99.7
5 d/115 h	300	4.65 x 106	99.4
6 d/139 h	300	3.90 x 106	98.1
7 d/163 h	300	2.55 x 106	81.8

Z大比生长速率μmax为0.024 h^-1，倍增时间td =28.9h。

c) 在1000ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行：

天/小时 – 步骤	体积（mL）	每毫升细胞浓度	存活百分比
0 d/0 h – 接种	150	6.6 x 105	98.9
1 d/23 h – 补料	150 (+ 50 mL)	9.6 x 105	98.9
2 d/45 h – 补料	200 (+ 50 mL)	1.95 x 106	99
3 d/66 h – 补料	250 (+ 50 mL)	1.10 x 106	99.3
4 d/93 h	300	2.18 x 106	99.4
5 d/117 h –   15-fold dilution	400 (max. 40%)	2.25 x 106	98.5
8 d/189 h	400	1.40 x 106	66.9

Z大比生长速率μmax为0.044 h^-1，倍增时间td =15.65h。

d) 蒸汽加湿
为了检测每日液体损失，使用125 mL摇瓶，工作体积为15 mL、20 mL和25 mL，在温度为37°C，湿度为85% rH的培养前后测定总体积。

5. 分析
a)  参数分析
每天使用细胞计数器yc100（Chemotec）测定活细胞浓度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus（Nova Biomedical）完成生长和生产基质的分析

b)公式                                                                                                                   
对于Z大生长速率μmax和倍增时间td的计算，使用以下公式。

6. 结果分析
为了优化CHO种子液培养，在Multitron细胞培养摇床中设置了三个不同体积的摇瓶（250ml、500ml和1000ml）。在培养CHO-XM-111细胞的同时，每天取样检测，从而可以**地比较细胞浓度、底物消耗和缓冲液。

对比Z大细胞浓度表明，500ml 摇瓶中的培养物每毫升可产生4.65×106个细胞。在培养物中，6天内可达到98%以上的存活率。通过优化补料策略，种子培养可在2天后进行，Z多5天（图2）。

图2：对比细胞浓度和活力

葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量，尤其在500mL摇瓶中，表明底物在第五天之前是足够的，因此补料可防止底物限制（图3）.

图3：对比葡萄糖和谷氨酰胺

已知同时形成铵，乳酸和谷氨酸可降低细胞生长速率。在培养物中，在培养的第五天也观察到亚临界浓度的铵。此外，通气和连续供应5％的CO₂可以为培养系统提供**缓冲，因此也可以提供合适的pH条件（图4）。

图4:比较铵的含量，谷氨酸盐，乳酸和pH

直接蒸汽加湿对培养基损失有重要影响，同时也会改变渗透压。
特别是在小工作体积下，一天的Z大蒸发量小于0.4%。

图5:125mL挥发量

摇瓶的工作体积对氧交换有很大影响，不应超过摇瓶Z适工作体积。

7. 总结

培养2-5天后，细胞总数达到1.8 x 10⁸和1.4 x 10⁹之间。它可用作2.5L生物反应器的接种物，活细胞浓度约为每毫升5×10⁵。
接种细胞密度和细胞活力越高，培养过程中细胞密度越高。
**尽早更换培养基
在较小接种量和**补料策略允许的情况下，可额外补充细胞培养营养物质。另一方面，培养液被稀释，因此有毒产物减少。
在85%相对湿度条件下，蒸发量小于0.5%，可实现稳定的渗透压和工艺再现性。

摇瓶培养可用于进一步的工艺步骤，例如接种生物反应器或一次性袋。

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